Luận văn Nghiên cứu ứng dụng hạt Nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp Sers

Nội dung tài liệu: Luận văn Nghiên cứu ứng dụng hạt Nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp Sers

1. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI -------------------------------- NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG HẠT NANO ĐA CHỨC NĂNG TRONG ĐÁNH DẤU TẾ BÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SERS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015
2. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI -------------------------------- NGUYỄN THỊ HÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG HẠT NANO ĐA CHỨC NĂNG TRONG ĐÁNH DẤU TẾ BÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SERS Chuyên ngành: Vật lý chất rắn Mã số: 60440104 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀNG NAM TS. NGUYỄN ĐÌNH THẮNG Hà Nội - 2015
3. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Thầy giáo TS. Nguyễn Hoàng Nam và Thầy giáo TS. Nguyễn Đình Thắng. Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, các thầy luôn tận tình chỉ bảo và giúp em định hướng để hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn NCS Lưu Mạnh Quỳnh, NCS Chu Tiến Dũng đã trực tiếp hướng dẫn cũng như đưa ra những lời khuyên thực sự hữu ích cho luận văn. Kết quả của luận văn là một trong những thành quả của quá trình lao động trí tuệ tích cực của nhóm nghiên cứu “Nghiên cứu chế tạo, chức năng hóa, tính chất của hạt nano đa chức năng nhằm ứng dụng trong y sinh học” trong định hướng “Nghiên cứu ứng dụng vật liệu nano trong y sinh” do TS. Nguyễn Hoàng Nam chủ trì và được tài trợ bởi đề tài “Nghiên cứu chế tạo hạt nano đa chức năng nhằm ứng dụng trong y sinh” mã số CA.14.11A. Tôi xin cảm ơn sinh viên Bạch Thị Mai - K58 KHVL, Khoa Vật lý đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và chế tạo vật liệu. Tôi cũng xin cám ơn học viên cao học K24 Nguyễn Thị Thơ tại Khoa Sinh học đã hỗ trợ luận văn trong quá trình nuôi cấy và định lượng tế bào. Tôi xin được cảm ơn các anh chị và các bạn sinh viên tại Trung tâm Khoa học Vật liệu và Khoa Sinh học đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu của mình. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, tập thể cán bộ của Trung tâm Khoa học Vật liệu – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian em làm thí nghiệm tại trường! Em cũng xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý cũng như lãnh đạo Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị để em hoàn thành luận văn này. Bản luận văn này được thực hiện tại Trung tâm Khoa học Vật liệu – Khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội. Luận văn sử dụng một số phép đo thực hiện trên các hệ LABRAM3 hãng HORIBA Jobin Yvon,
4. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà NanoSEM NOVA NPE 119, kính hiển vi huỳnh quang – trường tối AXIO Scope A1, Zeiss được đầu tư theo chương trình “Tăng cường năng lực nghiên cứu, đào tạo lĩnh vực khoa học, công nghệ nano và ứng dụng trong y, dược, thực phẩm, sinh học, bảo vệ môi trường và thích ứng biến đổi khí hậu theo hướng pháp triển bền vững”. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Hà nội, năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hà
5. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN .................................................................................... 5 1.1. Tổng quan về hạt nano Fe3O4 và hạt nano kim loại Ag 5 1.1.1. Vật liệu sắt từ..................................................................................................... 5 1.1.2. Tính chất siêu thuận từ ...................................................................................... 5 1.1.3. Vật liệu oxit sắt từ Fe3O4 ................................................................................... 7 1.1.4. Ứng dụng của hạt nano từ Fe3O4 ....................................................................... 7 1.1.5. Hạt nano Bạc và tính chất.................................................................................. 8 1.1.6. Cộng hưởng Plasmon bề mặt [14] ..................................................................... 8 1.1.7. Tán xạ Raman [10] ............................................................................................ 9 1.1.8. Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag .................................................. 13 1.2. Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào 14 1.2.1. Bệnh ung thư ................................................................................................... 14 1.2.2. Các phương pháp phát hiện bệnh ung thư ....................................................... 14 1.2.3. Các thụ thể tế bào (ErbB receptors) ................................................................ 15 1.2.4. EGFR- Epidermal growth factor receptor [49] ............................................... 17 1.2.5. Kháng thể ........................................................................................................ 18 1.2.6. Kháng thể anti-EGFR và cơ chế gắn kết kháng thể anti-EGFR với hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2 ........................................................................................ 19 1.2.7. Tế bào HaCaT và SK-Mel 28 .......................................................................... 20 CHƢƠNG 2 – THỰC NGHIỆM ........................................................................... 23 2.1. Chế tạo hạt nano chức năng Fe3O4/Ag ... 23 2.1.1. Hóa chất sử dụng ............................................................................................. 23 2.1.2. Chức năng hóa hạt nano Fe3O4 với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) tạo nhóm amine NH2 tự do Fe3O4-NH2 ..................................................................... 23 2.1.3. Chế tạo hạt nano composite Fe3O4/Ag ............................................................ 24 2.1.4. Chức năng hóa bề mặt hạt nano composite Fe3O4/Ag bằng 4-aminothiophenol (4-ATP) - Fe3O4/Ag-NH2 .......................................................................................... 25
6. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà 2.2. Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag trong đánh dấu tế bào 26 2.2.1. Hóa chất sử dụng ............................................................................................. 26 2.2.2. Gắn hạt nano composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 với kháng thể anti- EGFR .. ...26 2.2.3 Gắn hạt nano đa chức năng với hai dòng tế bào HaCaT và SK-Mel 28 .......... 27 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 33 3.1. Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag 33 3.1.1. Hạt nano Fe3O4 chức năng hóa với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) ...33 3.1.2. Hạt nano composite Fe3O4/Ag ........................................................................ 35 3.1.3 Chức năng hóa hạt nano composite Fe3O4/Ag với 4-aminothiophenol ........... 40 3.2. Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag trong đánh dấu tế bào .42 3.2.1 Hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag gắn với kháng thể anti-EGFR ................... 42 3.2.2 Đưa hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag gắn kháng thể anti-EGFR lên hai dòng tế bào Hacat và SK-Mel 28 ....................................................................................... 46 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 56
7. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Stt Hình vẽ Nội dung Trang 1 Hình 1.1 Đường cong từ hoá sắt từ (---) và siêu thuận từ (---) 6 2 Hình 1.2 Hc phụ thuộc vào đường kính hạt 6 Mô tả hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt của 3 Hình 1.3 9 hạt nano kim loại 4 Hình 1.4 Mô hình tán xạ Raman của phân tử CH4 10 5 Hình 1.5 Mô phỏng hoạt động của các loại ErbB 15 Hình vẽ mô phỏng cấu trúc các loại ErbB và các 6 Hình 1.6 16 phối tử của chúng 7 Hình 1.7 Mô hình của một kháng thể điển hình 19 8 Hình 1.8 Cấu trúc 3 chiều của anti-EGFR 19 Mô hình liên kết giữa hạt nano gắn kháng thể anti- 9 Hình 1.9 20 EFGR với các thụ thể trên bề mặt tế bào Mô hình tế bào Keratinocyte và Melanocyte trong 10 Hình 1.10 21 da 11 Hình 1.11 Mô hình tóm tắt mục tiêu luận văn 22 12 Hình 2.1 Mô hình phản ứng chức năng hóa Fe3O4 với APTES 23 Quy trình chế tạo hạt nano composite đa chức năng 13 Hình 2.2 25 Fe3O4/Ag-NH2 Mô tả phương pháp phân tích cường độ sáng của tế 14 Hình 2.3 30 bào bằng phần mềm Image J 15 Hình 2.4 Đồ thị tính toán cường độ sáng của tế bào và nền 31 16 Hình 3.1 Nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4 34
8. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà 17 Hình 3.2 Ảnh TEM của các hạt nano Fe3O4 34 18 Hình 3.3 Đường cong từ trễ của mẫu Fe3O4 35 19 Hình 3.4 Nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4/Ag 36 20 Hình 3.5 Phổ tán sắc năng lượng EDS của mẫu Fe3O4/Ag 36 Phổ UV-Vis và ảnh TEM của hạt nano Ag kích 21 Hình 3.6 37 thước từ 15-25 nm Phổ UV-Vis và ảnh TEM của hạt nano Ag kích 22 Hình 3.7 38 thước từ 25-50 nm Phổ hấp thụ UV-Vis và ảnh TEM của mẫu hạt nano 23 Hình 3.8 39 composite Fe3O4/Ag Đường cong mômen từ phụ thuộc từ trường ở nhiệt 24 Hình 3.9 40 độ phòng của Fe3O4 (a) và Fe3O4/Ag (b) Phổ Raman mẫu hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag- 25 Hình 3.10 41 NH2 Sơ đồ phản ứng của hạt nano Fe3O4/Ag-NH2 với 26 Hình 3.11 43 kháng thể anti-EGFR. Phổ Raman của mẫu hạt Fe3O4/Ag-NH2 trước và 27 Hình 3.12 44 sau khi gắn kháng thể anti-EGFR Phổ Raman của hạt nano gắn kháng thể anti-EGFR 28 Hình 3.13 45 và phổ Raman của Protein Nguyên lý sử dụng phổ SERS trong chẩn đoán tế 29 Hình 3.14 47 bào mang bệnh Phổ Raman của tế bào HaCaT và kháng thể anti- 30 Hình 3.15 47 EGFR Phổ Raman của tế bào SK-Mel 28 và kháng thể 31 Hình 3.16 48 anti-EGFR 32 Hình 3.17 Phổ SERS của tế bào HaCaT và SK-Mel 28 với tỉ lệ 49
9. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà gắn hạt M1 và M2. Ảnh hiển vi trường sáng và trường tối của tế bào 33 Hình 3.18 50 HaCaT. Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình của tế 34 Hình 3.19 bào HaCaT trước và sau khi gắn hạt nano 51 composite đa chức năng Ảnh hiển vi trường sáng và trường tối của tế bào 35 Hình 3.20 52 SK-Mel 28 Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình của tế 36 Hình 3.21 bào SK-Mel 28 trước và sau khi gắn hạt nano đa 53 chức năng So sánh cường độ sáng trung bình của hai tế bào 37 Hình 3.22 54 HaCaT và SK-Mel 28
10. Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Hà DANH MỤC BẢNG BIỂU Stt Tên bảng Nội dung Trang Bảng các loại HER receptor và các bệnh ung thư 1 Bảng 1.1 16 đi liền với chúng Bảng so sánh % tế bào có đột biến về số lượng 2 Bảng 1.2 17 EGFR Bảng tỉ lệ hạt nano Fe3O4/Ag-NH2-anti EGFR gắn 3 Bảng 2.1 27 với tế bào Khoảng cách d tính được ứng với các mặt nhiễu xạ 4 Bảng 3.1 33 tia X 5 Bảng 3.2 Tỉ phần các nguyên tố trong mẫu Fe3O4/Ag 37 Vị trí đỉnh phổ SERS của mẫu hạt nano đa chức 6 Bảng 3.3 42 năng Fe3O4/Ag-NH2 Vị trí đỉnh dao động của hạt nano gắn kháng thể 7 Bảng 3.4 45 anti-EGFR Bảng khảo sát hiệu suất gắn kết tế bào với hạt 8 Bảng 3.5 46 nano Fe3O4/Ag-NH2 Vị trí đỉnh dao động của tế bào gắn hạt nano đa 9 Bảng 3.6 48 chức năng